Tuesday, August 23, 2016

Hyriopsis cumingii atau Sinohyriopsis cumingii adalah kerang air tawar dan sebagian besar spesies yang penting dalam budaya mutiara di Cina. Kerang jenis ini merupakan spesies kerang yang menghasilkan mutiara yang berkualitas tinggi dalam hal warna, kilau, dan bentuk. Spesies ini banyak ditemukan di danau atau sungai di Cina. Baru-baru ini populasi kerang telah mengalami penurunan secara signifikan karena adanya over-eksploitasi, penurunan habitat, dan pencemaran lingkungan.Untuk mengatasi berbagai kendala tersebut maka kita harus mengetahui sistem perkawinan dari kerang mutiara di alam. Untuk mengetahui strategi reproduksi maka dilakukan penelitian dengan menggunakan metode kultur sel dari kerang jenis ini sehingga bisa diperoleh kembali mutiara dari kerang ini (Bai, 2012).
Nacre disekresi oleh sel-sel epitel kerang sebagai mekanisme pertahanan untuk melawan benda asing yang tersangkut di dalam jaringan mantel, misalnya bakteri. Nacre tersusun atas campuran kalsium karbonatdan beberapa protein (protein utama adalah conchiolin) yangdiproduksi oleh sel-sel epitel mantel. Namun, di dalam kondisi in vitro, nacre dapat dirangsang ketika kerangkontak dengan beberapa faktor yang menyebabkan stres, termasuk dalammedium kultur. Dalam pembentukan nacre secara in vitro dibentuk dari matriksprotein dari sel epitel mantel dan kalsium karbonat sebagai komponen mediakultur (Phuc et al., 2011).
Penelitiankulturin vitrosel mantel epiteluntuk sekresi kristalnacre padakerangmutiara air tawar,Sinohyriopsiscumingii yang dilakukanolehPhuc et al. (2011), menggunakanempatmacamvariasi media yang terdiriatasmedium DMEM/F12, Medium L15-M199, Medium IMDM, danMedium TCM. Prosedur yang digunakan untuk mengetahui jenis medium yang paling baik untuk digunakan yaitu dengan cara melakukan suatu percobaan secara in vitro pada medium yang berbeda untuk merangsang pembentukan kristal nacre pada mantel epithel kerang mutiara air tawar Sinohyriopsis cumungii. Adapunprosedur kerja dari percobaan ini yaitu sebagai berikut :
1.      Sterilisasi Kerang
a.       Kerang segar Sinohyriopsis cumingii berbagai ukuran distreilisasi dengan autoclave, kemudian kemudian dicuci dengan air sabun secara hati-hati dan bagian cangkang kerang digosok dengan sikat logam sampai cangkang luar kerang bersih.
b.      Setelah itu kerang ditempatkan pada UVA chamber selama 20 menit dan mulut kerang disterilkan dengan etanol 70%.
2.      Isolasi dan sterilisasi mantel epithel kerang
a.       Kerang yang telah disterilkan kemudian dibedah untuk mendapatkan mantel epithel. Manthel epithel kerang juga diterilisasi dengan dua metode.
b.      Metode A (Gong et al., 2008) dilakukan dengan cara sampel mantel epithel yang didapat direndam dalam antibiotik solution A (fungizone 2000 µg, penisilin 100.000 IU, streptomycine 100.000 µg, kanamycin 500.000 µg dan 10 ml air suling dan disterilisasi dengan filter) sebanyak empat kali, selama 15 menit setiap kalinya. Setelah itu sampel mantel epithel dicuci dengan air suling sebanyak empat kali, selama 15 menitsetiap kalinya. Prosedur yang terakhir ini diulang sebanyak tiga kali.
c.       Metode B (Edward dan Frank, 1979) dilakukan dengan cara sampel dicuci dengan air murni sebanyak enam kali, kemudian direndam etanol 10% selama 15 menit, setelah itu sampel dicuci dengan air suling sebanyak empat kali. Kemudian direndam dalam antibiotik solution B (fungizone 5000 µg, penisilin 200.000 IU, streptomycin 200.000 µg, kanamycin 100.000 µg, gentamycin 124.000 µg, air suling 10 mldan disterilkan dengan filter) selama 10 menit, kemudian dicuci dan diterilkan selama enam kali.
3.      Kultur dilakukan cara mendisosiasi fragmen jaringan hingga berukuran 1-2 mm2 kemudian diletakkkan kedalam media kultur yang berbeda yaitu DMEM/F12, TCM 199 (L’15-M199), IMDM, dan TCM. Evaluasi dari media dilakukan dengan empat kriteria yaitu waktu dimana sel-sel yang menyebar muncul, presentase jaringan fragmen yang muncul, proliferasi sel dalam media, dan suhu yang tepat. Evaluasi kondisi suhu didasarkan pada waktu dimana sel muncul dan jumlah sel.
4.      Pengamatan hasil dilakukan dengan mengamati perubahan sel kristal nacresetelah 7, 15, 21, 30, 37, 45, 52, dan 60 hari setelah penanaman fragmen dan setiap empat harinya medium harus selalu diganti.Untuk memacu perkembangan mantel epithel dilakukan penambahan dua faktor pertumbuhan yaitu bFGF (basicfibroblast Growth Factor) dan EGF (Epidermal Growth Factor). Kedua faktor inilah yang akan merangsang sekresi sel kristal nacre.
5.      Pengamatan jumlah sel kristal nacre dihitung secara langsung di bawah mikroskop.
Hasil evaluasi dari penelitian menunjukkan bahwa kultur yang telah dilakukan disosiasi fragmen jaringan hingga berukuran 1-2 mm2 kemudian diletakkkan kedalam media, menghasilkan hasil kultur yang berbeda-beda. Fragmen jaringan yang diletakkan pada media DMEM/F12, setelah 12 jam, sel-sel mulai menyebar dari fragmen jaringan. Jika dibandingkan dengan penelitian Barik et al. (2004), sel-sel menyebar setelah 24 jam. Dengan demikian, hasil penelitian telah menyebarkan sel-sel lebihcepat. Padaawalnya, sel-sel membelah diri secara perlahan (5.24%), hal ini disebabkan karena adanya beberapa faktor yang mempengaruhi antara lain, pertama, sel mungkin tidak beradaptasi dengan media baru, kedua, adanya factor kontaminasi, hal ini merupakan salah satu kesulitan dalam kultur moluska, prolifereasi bakteri jauh lebih cepat dibangingkan dengan sel, sehingga diperlukan antibiotic untuk membatasi pertumbuhan dan menghancurkan bakteri, namun antibiotic juga dapat membatasi kecepatan proliferasi sel, ketiga, perubahan media seringkali menyebabkan sel mengalami stres, bakteri meningkat dengan cepat dalam kultur sehingga dapat menghabiskan banyak nutrisi dan menghasilkan limbah berbahaya, dan perubahan sifat fisik dan kimia dari media mengarahkan penurunan pH yang dapat membahayakan sel (Phuc et al., 2011).
Untuk mengatasi hal ini diperlukan melakukan pergantian media setiap 12 jam. Strategi ini membantu memecahkan dua masalah antara lain menghilangkan bakteri pada media dan memasok factor nutrisi yang cukup bagi sel. Namun, strategi ini juga menyebabkan sel hilang dalam suspensi. Jumlah sel meningkat 147,85% ketika mencapai 120 jam dibandingkan pada saat 12 jam. Hasil proliferasi ini membuktikan bahwa sel stabil dan mulai meningkatkan jumlahnya . Hal ini menunjukkan bahwa setelah waktu dekontaminasi, bakteri hamper benar-benar hilang, karena jumlah bakteri yang rendah ini, antibiotic dalam medium cukup untuk pengendalian proliferasi bakteri; Selanjutnya, sel-sel mulai beradaptasi dengan media baru (Phuc et al., 2011).
Medium DMEM (Dulbecco’s modified eagle medium) merupakan medium basal yang terdiri dari vitamin, asam amino, garam, glukosa, dan pH indikator. Namun, media ini tidak mengandung protein atau agen penumbuh. Media ini membutuhkan suplementasi untuk menjadi medium yang lengkap. Umumnya media ini disuplementasi dengan 5-10% Fetal Bovine Serum (FBS) (Nooryani, 2011). Selain itu, DMEM juga membentuk sistem buffer sodium bicarbonate (3.7 g/L) dan tentunya membutuhkan tingkat karbon dioksida buatan untuk membuat pH tetap pada kisaran yang diinginkan. 7-10% CO2 merupakan tingkat yang optimal tapi banyak peneliti yang sukses menggunakan CO2 sebesar 5%. Masalah potensial dari rendah nya tingkat CO2 adalah pH dapat menjadi sangat tinggi. Saat terekspos pada tingkatan ambient dari CO2, sodium bicarbonate akan membuat DMEM menjadi basa secara cepat. Inilah yang merupakan alasan kenapa kita umum mengamati media yang berwarna ungu yaitu mengindikasikan peningkatan dari pH (Invitrogen, 2009).
Fragmen jaringan yang diletakkan pada mediaMedium L15-M199, setelah 12 jam kultur, semua fragmen jaringan muncul sel menyebar. Jika dibandingkan dengan penelitian kultur sel jaringan mantel Gong et al. (2008), sel-sel seperti hemosit muncul setelah 4 hari (96 jam). Dalam media ini, ada dua populasi yang sama dengan media DMEM / F12, tetapi rasio setiap jenis sel berbeda, persentase frasel epitel dan populasi hemosit masing-masing adalah 23,72dan 58,14%. Media ini mengandung fenol merah sebagai pH indikator. Warna merahmu dan menjadi kuning jika semakin lama; kultur biasanya harus dipindahkan ke media segar segera setelah warna berubah.
Fragmen jaringan yang diletakkan pada media Medium IMDM (The Iscove Modified Dulbecco’s Medium). Setelah 12 jam, sel-sel menyebar muncul dari fragmen jaringan dengan rasio 97,66%. Pada tahap pertama (12-24 jam), perlahan sel-sel meningkat jumlahnya, sekitar 4.41%. Berikutnya, sel disesuaikan dengan media baru dan berkembangbiak dengan cepat. Sama seperti Media DMEM/F12 dan Media L15-M199, Media IMDM juga memiliki populasi dua sel menguntungkan: hemosit (42,12%) dan sel epitel (25,40%), IMDM merupakan modifikasi Dulbecco dan dianggap sebagai media yang lebih kompleks dan diperkaya, mengandung L-Glutamine, tanpa Alpha-Thioglycerol, tanpa Beta-Mercaptoethanol. Hal ini digunakan tidak hanya untuk jenis sel yang lebih khusus, tetapi juga sebagai dasar untuk beberapa formulasi Serum-Free Media lebihunik. IMDM merupakan modifikasi dari DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) yang mengandung selenium, tambahan AA, vitamin dan komponen lainnya. IMDM merupakan media sintetis yang sangat diperkaya cocok untuk mempercepat proliferasi dan kultur sel high-density dalam suasana CO2 5%.
Fragmen jaringan yang diletakkan pada Medium TCM Pada tahap inkubasi kultur 0-12 jam, sel meyebar di sekitar jaringan fragmen. Pada tahap 12-24 jam, Medium TCM mempunyai kecepatan proliferasi sel tertinggi dibandingkan dengan tiga media lainnya. Medium TCM juga memiliki populasi dua sel menguntungkan, rasio sel hemosit tinggi (43,73%) dan rasio sel epitel rendah (20,18%). Secara umum,medium untuk produksi embrio in vitro dibedakan menjadi medium kompleks dan sederhana. Tissue culture medium (TCM)-199 merupakan medium kompleks yang bersifat komersial dan telah digunakan untuk produksi embrio sapiyang dalam penggunaannya digunakan suplementasi FBS 10% (Boediono et al., 2006). Komposisi bahan penyusun TCM yaitu terdiri dari sumber energi, garam anorganik, bufer, asam amino, dan vitamin.
Dari hasil yang didapatkan, makaperlakuan, metode kultur utamasel epitel disarankan sebagai berikut, yaitu menggunakan metode dekontaminasiEdward dan Frank (2004), kultur dilakukan pada suhu 24 ° C dan medium yang digunakan adalah L15-M199. Dengan menggunakan metodeini, sel-sel akan muncul setelah 12 jam, namun populasi seltidak identik terhadap kecepatan proliferasi. Kristal nacre akan meningkat (selama 60 hari) dan sekresi nacre tidak bergantung pada beberapa agen pelengkap seperti EGF, FGF dan Ca2+ untuk mempelajari konsentrasi. Dihasilkannya kristal nacre dengan menggubakan metode kultur sel jaringan mantel kerang merupakan aplikasi kultur jaringan hewan yang penting untuk mencari dan mengevaluasi produksi kerangmutiara untuk mengevaluasi dan skrining teknik yang baik untuk memproduksi kerang mutiara yang dapat diaplikasikan dalam bidang kosmetik, dan obat-obatan (Phuc et al., 2011).


Gambar 1. Metode Diseksi Mantel 
Reactions:

0 comments:

Post a Comment

Hak Cipta Dilindungi. Powered by Blogger.

Translate

Total Pageviews

Popular Posts

Recent Post

Recent Posts Widget

Web Hosting Unlimited, Daftar Sekarang!

Hosting Unlimited Indonesia